No.217 バイアスリガンドの同定にPathHunter®セルベースアッセイ

本日はこれまでのブログ記事の中でも人気の高い記事の一つ、バイアスリガンドに関する記事を再掲載させていただきます。

DiscoverX独自のEnzyme Fragment Complementation (EFC) 技術を用いたPathHunterセルベースアッセイでは、Gタンパク質結合受容体（GPCR) に対する複数の機能アッセイ（β‐アレスチン、セカンドメッセンジャー、内在化）を提供しています。

GPCRが活性化されると、Gタンパク質依存的またはGタンパク質非依存的な事象の両方を引き起こしますが、DiscoverXのアッセイ方法は強制カップリングを行っておりませんので、細胞生物学を乱さずに各シグナル経路を定量的に評価することが可能です。

これらの特徴をもつPathHunterアッセイは、バイアスリガンドの同定にも最適です。

PathHunter GPCRシグナル経路プロファイリング原理

Fig. 1. 機能的セルベースアッセイの幅広い選択肢　

(左)　セカンドメッセンジャー (cAMP/Calcium) ：検証済み細胞株を用いた高感度かつ確実なセカンドメッセンジャーアッセイ

(中)　β‐アレスチン：Gタンパク質に非依存的なβ‐アレスチン誘導を利用したアッセイであり、あらゆる薬理作用の評価に対応
(右)　GPCR内在化：直接的かつ定量的にGPCRの内在化(エンドサイトーシス)を評価

A G Protein-Biased Ligand at the µ-Opioid Receptor Is Potently Analgesic with Reduced Gastrointestinal and Respiratory Dysfunction Compared with Morphines

概要：

Gタンパク質結合受容体（GPCR) におけるバイアスリガンドとは、GPCRの各経路を選択的に活性化または非活性化する特徴をもったリガンドのことで、バイアスリガンドを用いることにより、より安全で選択性のある治療法の開発が期待されます。β‐アレスチン-2ノックアウトマウスを用いたモルヒネの薬理作用の研究から、リガンドがβ‐アレスチン-2の誘導を引き起こさずに、ヒトµオピオイド受容体(hMOR)のGタンパク質シグナル経路のみを促進した場合には、通常よりも高い鎮痛作用が得られ、かつ副作用(胃腸機能障害および呼吸抑制)が軽減されることがわかっています。本文献では、DiscoverX社PathHunter細胞株・アッセイを用いて、hMORのGタンパク質バイアスリガンド候補物質であるTRV130についての機能評価を報告しています。

Fig. 2. TRV130は、hMORに対するGタンパク質バイアスリガンド候補物質である。(A) モルヒネと比較して、 (B) TRV130はモルヒネと同等にGタンパク質カップリングによりシグナル伝達経路を活性化させるものの、β‐アレスチン-2の誘導が抑制されている。β‐アレスチン-2の誘導は、化学発光法を用いたβ‐ガラクトシダーゼ活性を利用して測定し、Gタンパク質カップリングは、cAMPの蓄積の抑制効果を測定した。いずれもhMORを発現したHEK細胞(DiscoverX社PathHunter細胞株)を使用した。

Fig. 3. TRV130はモルヒネと比較して、hMORの内在化とリン酸化 (S375)を抑制することが示された。

ご希望の方には、最新のターゲットリストをお送りさせていただきます。ターゲット一覧のみならず、細胞株やeXpressキット、受託試験サービスでの取り扱いの有無をご確認いただけます。下記申し込みフォームよりお気軽にご請求ください。

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PathHunterターゲットリスト・申し込みフォーム

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No.92 [お知らせ] GPCRバイアスリガンド研究ツール <特別割引キャンペーン実施中>

バイアスリガンド研究にもご活用いただける多様なGPCR評価アッセイ系

DiscoveRx社独自のEnzyme Fragment Complementation (EFC) 技術を用いたPathHunter®アッセイでは、Gタンパク質結合受容体(GPCR)に対する複数の機能アッセイ(セカンドメッセンジャー、β‐アレスチン2、内在化)を提供しています。 さらに、DiscoveRxのアッセイ方法ではGタンパク質の強制カップリングを行っていないため、細胞生物学を乱さずに各シグナル経路を定量的に評価することが可能です。 このように多様なシグナル経路を平行して検証することができるDiscoveRxのGPCR評価アッセイ系は、特異的なシグナル経路のみが活性化されるバイアスリガンドの研究・同定にもご活用いただけます。(お得なキャンペーン情報は本メール末尾をご覧ください。)  Fig.1. 複数のGPCR機能アッセイ (セカンドメッセンジャー、β‐アレスチン2、内在化)

【新サービス】gpcrBIAS受託サービス

リガンドバイアスによるシグナル伝達経路の傾向を指標付けするDiscoveRxの新サービスgpcrBIAS。600種類以上もの最大級のコレクションを誇るGPCR発現細胞株とTerry Kenakin*教授との共同研究により開発された定量化ツールを用いて、特性およびバイアスを解明します。(サンプルレポート:AGTR1、CCR5)
*Professor Terry Kenakin is in the Department of Pharmacology, UNC School of Medicine, Chapel Hill, NC.

Fig.2. Angiotensin類似体において、リガンドバイアスによるシグナル経路の選択性に差異があることが確認された

cAMP Hunter™細胞株・特別割引キャンペーン

 只今cAMP Hunter™細胞株を期間限定特別割引価格でご提供しています。DiscoveRxのcAMP Hunter™細胞株は、バイオ医薬品(ペプチドや抗体)、完全または部分的アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト、アロステリックモデュレーターなど、幅広い分子クラスの評価に用いることができ、他社のcAMPアッセイのバリデーションにも活用されています。是非この機会にご利用ください。(最新のターゲットリストはこちらから)

cAMP Hunter™細胞株　50％オフにてご提供

(期間限定) 2015年12月31日まで

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★ DiscoveRxでは、お客様の研究開発に役立つ最新技術やキャンペーン、セミナーの案内を定期的に配信しています。現在Eニュースに新規登録のお客様に、【The Druggable GPCRome】ポスターを進呈中！ →　Eニュース購読申し込みフォーム

★ 来る10月14日～16日にパシフィコ横浜で開催されるバイオジャパン2015に於いて、パートナリングプログラムへ参加いたします。弊社技術スタッフとの面談をご希望の方は、お気軽に申請、またはお問い合わせいただければ幸いです。

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No.68 セカンドメッセンジャー評価 HitHunter cAMPアッセイ

DiscoveRxでは、細胞内cAMPを検出する機能的セカンドメッセンジャーアッセイ・HitHunter^® cAMPアッセイを提供しています。本アッセイは、全長のGPCRを安定発現させた細胞株と、検出試薬によって構成されます。信頼性の高い検証済みプラットフォームを用いることで、スクリーニングを迅速かつ簡便に行うことができるだけではなく、アッセイ樹立にかかる時間を削減することができます。

HitHunter^® cAMPアッセイは、DiscoveRx社独自のEFC（Enzyme Fragment Complementation）技術を用いた競合免疫測定法です。活性型のβ-ガラクトシダーゼ酵素を2つに断片化し、一方をcAMPに標識しています。

このED標識cAMPが細胞内の遊離cAMPとcAMP抗体に競合結合をします。細胞内の遊離cAMPレベルが低い場合は、ED標識cAMPの大部分がcAMP抗体に結合し、enzyme acceptor (EA)と接近することはありません。逆に細胞内の遊離cAMPレベルが高い場合は、cAMP抗体と細胞内の遊離cAMPが結合するため、cAMP抗体に結合しないED標識cAMPが存在します。その結果、フリーなED標識cAMPがβ-gal acceptor (EA)と接近して活性酵素を再構成することが可能となります。この再構成されたβ-ガラクトシダーゼの酵素活性により化学発光基質を加水分解し、生じた化学発光シグナルを検出することで細胞内cAMPの発現量を測定することができます。

アッセイ原理












バイオ医薬品や低分子化合物の評価に適したアプリケーション

HitHunter cAMPアッセイは、確実で簡単に利用できるセルベースのcAMP検出アッセイです。
· 幅広いアッセイウィンドウ
· 少ない細胞数でアッセイ可能　
· 高い血清耐性
· HTSアッセイフォーマットに対応（3456ウェルまで微量化可能）
· 標準的なルミノメーターによるシグナル検出
· バイオ医薬および低分子化合物に最適化されたアッセイ
· 400件以上の査読された文献による実績
· ワンステップのプロトコル

上記のような特徴を持つHitHunter cAMP アッセイは、バイオ医薬品(ペプチドや抗体)、完全または部分的アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト、アロステリックモデュレーターなど、幅広い分子クラスの評価に用いることができます。 

複雑なアッセイでも評価可能

バイオ医薬品の最適化

Fig. 1 HitHunter cAMPアッセイは、多様なアプリケーションにご利用いただけます。(上)2種類の代謝型グルタミン酸レセプターへのアンタゴニストの結合を比較。複雑なアッセイでも測定可能であることを示す。(下)CXCR4 Gαi-共役受容体を発現する細胞株を用いてバイオ医薬品（SDF1α）の特性評価を行った。 

関連製品情報
・ Gs/Gi 共役型cAMP Hunter™ 細胞株 (ターゲット一覧)
・ cAMP検出試薬

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No.31 ドーパミン受容体におけるバイアスリガンドの評価

DiscoveRx社独自のEnzyme Fragment Complementation (EFC) 技術を用いたPathHunter^®アッセイでは、Gタンパク質結合受容体（GPCR) に対する複数の機能アッセイ （β‐アレスチン2、セカンドメッセンジャー、内在化）を提供しています。 さらに、DiscoveRxのアッセイ方法ではGタンパク質の強制カップリングを行っていないため、細胞生物学を乱さずに各シグナル経路を定量的に評価することが可能です。このような特長をもつPathHunterアッセイは、バイアスリガンドの同定にもご活用いただけます。

(左)セカンドメッセンジャー (cAMP/Calcium) ：検証済み細胞株を用いた高感度かつ確実なアッセイ  (中)β-アレスチン：Gタンパク質に非依存的なβ‐アレスチン補充を用いたアッセイ、あらゆる薬理作用の評価に対応 (右)GPCR内在化：直接的かつ定量的にGPCRの内在化(エンドサイトーシス)を評価

先日の記事に引き続き、DiscoveRx社独自のEnzyme Fragment Complementation (EFC) 技術を用いたPathHunter®アッセイを利用して、ドーパミンD1およびD2受容体でのGタンパク質およびβ-アレスチンを介したシグナル伝達経路におけるバイアスリガンドを明らかにしたデータが発表されていますので、ご紹介致します。

A: ドーパミン受容体・D1R安定発現細胞において、アゴニストの刺激によるcAMPの蓄積、β-アレスチンの補充および受容体の内在化の変化をそれぞれ評価した。 (Conroy et al. 2015). B: ドーパミン受容体D2Rに対してネイティブのリガンドおよび臨床的相関が明らかとなっている化合物を用いて、 Gαi/o活性化によるcAMP生成抑制効果を評価した。 (Brust et al.2015).

ドーパミン受容体に関連する製品およびサービス
· ドーパミン受容体安定発現細胞株
· 複数のアッセイフォーマット(β-アレスチン・cAMP・内在化)
· オーソログ・アッセイキットや受託サービスなど、多様なオプション

ドーパミン受容体・ターゲット一覧
· Human: DRD1, DRD2L, DRD2S, DRD3, DRD4, DRD5 
· Orthologs: mDRD5, rDRD1, rDRD2L, rDRD2S

参考文献

Identification of G Protein-BiasedAgonists That Fail To Recruit β-Arrestin or Promote Internalization of the D1Dopamine Receptor.

Bias analyses of preclinical andclinical D2 dopamine ligands: studies with immediate and complex signalingpathways.

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バイアスリガンドの同定には、DiscoveRx社のPathHunter/HitHunterがお勧めです。

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No.5 バイアスリガンドの同定にはPathHunter®アッセイが活用できます

DiscoveRx社独自のEnzyme Fragment Complementation (EFC) 技術を用いたPathHunter^®アッセイでは、Gタンパク質結合受容体（GPCR) に対する複数の機能アッセイ（β‐アレスチン、セカンドメッセンジャー、内在化）を提供しています。

GPCRが活性化されると、Gタンパク質依存的またはGタンパク質非依存的な事象の両方を引き起こしますが、DiscoveRx社のアッセイ方法は強制カップリングを行っておりませんので、細胞生物学を乱さずに各シグナル経路を定量的に評価することが可能です。

これらの特徴をもつPathHunterアッセイは、バイアスリガンドの同定にもご活用いただけます。本日は弊社PathHunterアッセイを用いて、バイアスリガンドを検証した実用例をご紹介させていただきます。

PathHunter GPCRシグナル経路プロファイリング原理

Fig. 1. 機能的セルベースアッセイの幅広い選択肢　

(左)　セカンドメッセンジャー (cAMP/Calcium) ：検証済み細胞株を用いた高感度かつ確実なセカンドメッセンジャーアッセイ

(中)　β‐アレスチン：Gタンパク質に非依存的なβ‐アレスチン誘導を利用したアッセイであり、あらゆる薬理作用の評価に対応(右)　GPCR内在化：直接的かつ定量的にGPCRの内在化(エンドサイトーシス)を評価

A G Protein-Biased Ligand at the µ-Opioid Receptor Is Potently Analgesic with Reduced Gastrointestinal and Respiratory Dysfunction Compared with Morphines

概要：

Gタンパク質結合受容体（GPCR) におけるバイアスリガンドとは、GPCRの各経路を選択的に活性化または非活性化する特徴をもったリガンドのことで、バイアスリガンドを用いることにより、より安全で選択性のある治療法の開発が期待されます。β‐アレスチン-2ノックアウトマウスを用いたモルヒネの薬理作用の研究から、リガンドがβ‐アレスチン-2の誘導を引き起こさずに、ヒトµオピオイド受容体(hMOR)のGタンパク質シグナル経路のみを促進した場合には、通常よりも高い鎮痛作用が得られ、かつ副作用(胃腸機能障害および呼吸抑制)が軽減されることがわかっています。本文献では、DiscoveRx社PathHunter細胞株・アッセイを用いて、hMORのGタンパク質バイアスリガンド候補物質であるTRV130についての機能評価を報告しています。

Fig. 2. TRV130は、hMORに対するGタンパク質バイアスリガンド候補物質である。(A) モルヒネと比較して、 (B) TRV130はモルヒネと同等にGタンパク質カップリングによりシグナル伝達経路を活性化させるものの、β‐アレスチン-2の誘導が抑制されている。β‐アレスチン-2の誘導は、化学発光法を用いたβ‐ガラクトシダーゼ活性を利用して測定し、Gタンパク質カップリングは、cAMPの蓄積の抑制効果を測定した。いずれもhMORを発現したHEK細胞(DiscoveRx社PathHunter細胞株)を使用した。

Fig. 3. TRV130はモルヒネと比較して、hMORの内在化とリン酸化 (S375)を抑制することが示された。

GPCRを多方面から評価できるDiscoveRx社のPathHunterでは、Ready-to-useのアッセイキット、細胞株および関連試薬など幅広い製品ラインナップを提供しております。

Target Listはこちらをご参照ください。

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バイアスリガンドの同定には、DiscoveRx社のPathHunter/HitHunterがお勧めです。

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